پایان نامه تولید آنزیمی استر 1- بوتیل اولئات با استفاده از سیستم سلولی قارچ رایزوپوس اوریزا

فهرست:

فصل اول.. 1

1    مقدمه. 2

فصل دوم. 7

مروری بر مفاهیم و مطالعات انجام شده. 7

2    پیش گفتار. 8

2.1   آنزیم.. 8

2.2   تاریخچه آنزیم.. 9

2.3   آنزیم لیپاز 10

2.4   تفاوت آنزیم لیپاز و کربوکسیل استراز 11

2.5   علل افزایش توجه محققان به آنزیم لیپاز 11

2.6   واکنش‌های آنزیم لیپاز 12

2.7   ویژگی‌های آنزیم لیپاز 14

2.7.1  خاصیت ساختاری (حضور درپوش بر جایگاه فعال) 14

2.7.2  فعال سازی سطحی.. 15

2.7.3  گزینش پذیری سوبسترا 16

2.7.4  مقاومت در برابر افزایش دما  و تغییرات(pH) 19

2.8   تولید آنزیم لیپاز 20

2.8.1  منابع تولید آنزیم لیپاز 20

2.8.2  مقایسه لیپازهای باکتریایی و قارچی و کاربردهای آن‌ها 22

2.8.3  لیپازهای قارچ‌های رشته‌ای.. 23

2.8.4  جداسازی آنزیم‌ها 24

2.8.5  رشد میکروارگانیسم و القا آنزیم.. 26

2.9   تثبیت سلولی.. 27

2.9.1  مقایسه مزایا و معایب  تثبیت آنزیم و سلول.. 27

2.9.2  کاربری آنزیم یا سلول تثبیت یافته. 29

2.9.3  روش‌های تثبیت سلول.. 30

2.9.4  انتخاب نگاه‌دارنده و روش به منظور تثبیت سلولی.. 36

2.9.5  مکانیسم تراوشی و جایگاه لیپاز در سلولی قارچ رایزوپوس اوریزا و اثر تثبیت بر تراوش آن.. 42

2.10 روش‌های سنجش فعالیت آنزیم لیپاز 45

2.10.1    روش‌های سنجش فعالیت آبکافت آنزیم لیپاز 45

2.10.2    روش‌های سنجش فعالیت سنتزی آنزیم لیپاز 46

2.11 کاربردهای آنزیم لیپاز 47

2.12 واکنش‌های سنتز استر. 49

2.12.1    پارامترهای موثر بر پیشرفت واکنش سنتز استر. 51

2.12.2    سنتز استر 1-بوتیل اولئات... 54

فصل سوم. 62

مواد و روش‌ها 62

3   پیش گفتار. 63

3.1   مواد شیمیایی.. 63

3.2   وسایل و دستگاه‌های مورد استفاده 64

3.3   میکروارگانیسم.. 65

3.4   شرح انجام آزمایش‌ها 66

3.4.1  کشت جامد میکروارگانیسم.. 66

3.4.2  تولید محلول اسپور قارچ.. 66

3.4.3  کشت مایع میکروارگانیسم.. 68

3.5   تهیه بیوکاتالیست سلولی.. 68

3.5.1  اسفنج لوفا به عنوان نگاه‌دارنده سلولی.. 68

3.5.2  تثبیت قارچ رایزوپوس اوریزا و تهیه بیوکاتالیست... 68

3.5.3  تعیین میزان آب بیوکاتالیست سلولی.. 70

3.6   رسم منحنی رشد میکروارگانیسم رایزوپوس اوریزا  به فرم آزاد. 70

3.7   فعال سازی غربال‌های مولکولی.. 71

3.8   روش کدورت سنجی سنجش اسیدهای چرب آزاد. 71

3.8.1  تهیه محلول معرف استات مس- پیریدین.. 72

3.8.2  رسم منحنی استاندارد جذب اسید چرب آزاد جهت سنجش فعالیت استریفیکاسیون.. 72

3.9   سنجش فعالیت ویژه آنزیم.. 73

3.9.1  فعالیت سنتزی سیستم آنزیمی(بیوکاتالیست سلولی)-تولید استر. 74

3.9.2  فعالیت آبکافتی سیستم آنزیمی(بیوکاتالیست سلولی) 75

3.10 واکنش سنتز استر 1-بوتیل اولئات... 75

3.10.1    آنالیز جهت تعیین پیشرفت واکنش.... 76

3.10.2    آنالیز محصول تولیدی به روش کروماتوگرافی گازی- اسپکتروسکپی جرمی.. 76

3.11 انتخاب سیستم واکنشی سنتز استر1-بوتیل اولئات در حضور و عدم حضور حلال.. 77

3.11.1    سنتز استر 1- بوتیل اولئات در حضور حلال هگزان.. 77

3.11.2    سنتز استر 1- بوتیل اولئات در عدم حضور حلال.. 78

3.11.3    مقایسه اثر محدودیت‌های انتقال جرمی درون قطعه لوفا، بر سرعت اولیه واکنش در حضور حلال و عدم حضور حلال............. 78

3.12 بهینه سازی شرایط واکنش سنتز استر1-بوتیل اولئات در حضور حلال هگزان.. 81

3.12.1    بررسی اثر نسبت مولی حلال به سوبسترا بر بازدهی و سرعت واکنش.... 81

3.12.2    بررسی اثر افزایش غلظت سوبسترا الکلی.. 81

3.12.3    سوبسترای اسیدی.. 82

3.12.4    بررسی اثر غلظت کاتالیست بر بازدهی و سرعت اولیه واکنش.... 82

3.12.1    بررسی اثر حذف آب بر بازده واکنش.... 83

3.12.2    بررسی تغییرات بازده در استفاده پی‌درپی از بیوکاتالیست سلولی.. 83

فصل چهارم. 84

نتایج و تحلیل ها 84

4    پیش گفتار. 85

4.1   منحنی رشد رایزوپوس اوریزا 85

4.2   بررسی و مقایسه فعالیت بیوکاتالیست سلولی به فرم آزاد و تثبیت یافته. 86

4.2.1  فعالیت آبکافتی سیستم آنزیمی (بیوکاتالیست سلولی) 86

4.2.2  فعالیت سنتزی سیستم آنزیمی (بیوکاتالیست سلولی)- تولید استر. 88

4.3   انتخاب سیستم واکنشی سنتز استر1-بوتیل اولئات در حضور و عدم حضور حلال.. 89

4.3.1  سنتز استر 1-بوتیل اولئات در حضور حلال هگزان.. 89

4.3.2  سنتز استر 1-بوتیل اولئات در عدم حضور حلال.. 91

4.3.3  مقایسه پارامتر انتقال جرم درونی قطعه لوفا در حضور و عدم حضور حلال.. 92

4.4   بهینه سازی شرایط واکنش سنتز استر1-بوتیل اولئات در حضور حلال هگزان.. 97

4.4.1  بررسی اثر نسبت مولی حلال به سوبسترا بر بازدهی و سرعت واکنش.... 97

4.4.2  بررسی اثر غلظت کاتالیست بر بازدهی و سرعت اولیه واکنش.... 99

4.4.3  بررسی اثر افزایش غلظت سوبسترا الکلی.. 100

4.4.4  بررسی اثر افزایش غلظت سوبسترا اسیدی.. 101

4.4.5  بررسی اثر حذف آب بر بازده واکنش.... 103

4.4.6   بررسی تغییرات بازده در استفاده پی‌درپی از بیوکاتالیست سلولی.. 105

نتیجه‌گیری و پیشنهادات.. 107

5    پیش‌گفتار. 108

5.1   نتیجه‌گیری.. 108

5.2   پیشنهادات جهت مطالعات آتی.. 111

5.2.1  بیوکاتالیست... 111

5.2.2  بستر واکنش.... 112

5.2.3  شرایط واکنش.... 112

5.2.4  محصول.. 113

منابع و مراجع.. 114

پیوست... 114

منبع:

1.Sharma, R.; Chisti,Y.; Chand,U. ; “Production, purification, characterization, and applications of lipases”,Biotechnology Advance 19, 627–662, 2001

2.      Novozymes;page‌title: https://report2012.novozymes.com/Menu/The+Novozymes+Report+2012/Report/Company+profile

3.Gupta,R.; Gupta,N.; Rathi, P.; “Bacterial lipases: an overview of production, purification and biochemical properties”, Applied microbiology and biotechnology  64, 763-81, 2004

4.Yahya, Ahmad R. M.; Anderson, William A.; Murray Moo-Young; “ Ester synthesis in lipase catalyzed reactions”, Enzyme and Microbial Technology 23, 438–450, 1998

5.Hama, S.; Sriappareddy, T. ; Takahiro, F.; Kazunori, M.;Hideki, Y.;Akihiko, K.;Hideki, F.; “Lipase localization in Rhizopus oryzae cells immobilized within biomass support particles for use as whole-cell biocatalysts in biodiesel-fuel production”, Journal of bioscience and bioengineering 101,328-333, 2006

6.Salleh, A. B.; Musani, R.; Basri, M.; Ampon, M.; Yunus, W.M.Z.; Razak, C.N.A; “Extra and intra-cellular lipases from a thermophilic Rhizopus oryzae and factors affecting their production”, Can. J. Microbiol. 39, 1991-1994,1993

7.Chen, J.; Wang, J.; “Wax ester synthesis by lipase-catalyzed esterification with fungal cells immobilized on cellulose biomass support particles”,  Enzyme and Microbial Technology 20 , 615-622, 1997

8.Nakashima, T.; Fukuda, H.; Kyotani, S.;” Culture conditions for intracellular lipase production by Rhizopus chinensis and its immobilization within biomass support particles”, Journal of Fermentation Technology 66, 441-448, 1988

9.Baron, M.; Sarquiz, M. Inez M.; Baigori, M.; Mitchell, David, A.; kriger, N.;” A comparative study of the synthesis of n-butyl-oleate using a crude lipolytic extract of Penicillum coryophilum in water-restricted environments”, Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic  34, 25-32, 2005

10.Leon, R.; fernandes, P.; Pinheiro H.K.; Cabral J.M.S.; “Whole-cell biocatalysis in organic media”, Enzyme and Microbial Technology 23, 483-500, 1998

11.Drauz, K., &Waldmann, H.; “Enzyme Catalysis in Organic Synthesis: A Comprehensive Handbook, 2 vols” Berlin: Wiley-VCH, 2002

12.Gilham, D.; Lehner, R.;” Techniques to measure lipase and esterase activity in vitro”, Methods (San Diego, Calif.) 36, 139-147, 2005

13.Chahiniana, H.; Sarda, L.; “ Distinction Between Esterases and Lipases: Comparative Biochemical Properties of Sequence-Related Carboxylesterases”, Protein and Peptide Letter 16, Oct 2009

14.Bornscheuer, T.; “Microbial carboxyl esterases : classification , properties and application in biocatalysis”, FEMS Microbiology Reviews 26, 73-81, 2002

15.Villeneuve, P.;Muderhwab, J.M. ;Graillea, J.; Haas, M.J.; “Customizing lipases for biocatalysis: a survey of chemical, physical and molecular biological approaches”, Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic 9,113-148 ,2000

16.Gandhi, N.; “Applications of lipase”, Journal of the American Oil Chemists' Society 1997, 621-634, 1997

17.Schmid, R.; Verger, R.; “Lipases Interfacial Enzymes with attractive Applications”, Angew. Chem. Int. 37, 1608-1633, 1998

18.Kapoor, M.; Gupta, M.;” Lipase promiscuity and its biochemical applications”, Process Biochemistry 47 , 555-569, 2012

19. Hasan, F.; Shah, A.; Hameed, A.; “Methods for detection and characterization of lipases: A comprehensive review”, Biotechnology advances 27, 782-798,2009

20.Razak, C.N.A; Musani, R.; Basri, M.; “Characterization of membrane-bound lipase from a thermophilic Rhizopus oryzae isolated from palm oil mill effluent", Journal of the American Oil Chemists' Society 76, 171-174,1999

21.Razak, C.N.A;  Salleh A.B.; Musani, R.; Basri, M.; “Some characteristics of lipases from thermophilic fungi isolated from palm oil mill effluent", Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic 3,153-159,1997

22.Salleh, A. B.; Musani, R.; Basri, M.; Ampon, M.; Yunus, W.M.Z.; Razak, C.N.A; “Extra and intra-cellular lipases from a thermophilic Rhizopus oryzae and factors affecting their production”, Can. J. Microbiol. 39, 1991-1994,1993

23. Hama, S.; Tamalampudi, S.; Fukumizu, T.; Miura, K.; Yamaji, H.; Kondo, A.;  Fukuda, H.; Lipase localization in Rhizopus oryzae cells immobilized within biomass support particles for use as whole-cell biocatalysts in biodiesel-fuel production, Journal of bioscience and bioengineering 101, 328- 333, 2006

24.Wang, D.; Xu, Y.; Shan, T.;” Effects of oils and oil-related substrates on the synthetic activity of membrane-bound lipase from Rhizopus chinensis and optimization of the lipase fermentation media”, Biochemical Engineering Journal 41, 30-37, 2008

25.BiologyMad.com/modul2/enzymeTechnology

26. Long, K.; Ghazali, H.; Ariff, A.; Bucke, C.;” Acidolysis of several vegetable oils by mycelium-bound lipase of Aspergillus flavus “, Journal of the American Oil Chemists' Society 74, 1121-1128, 1997

27. Aravindan, R.; Anbumathi, P.; Viruthagiri, T.; “Lipase applications in food industry”, Indian Journal of Biotechnology 6, 141-158, 2007

28.Liao, W.; Liu, Y.; Frear, C.; Chen, S.;  “A new approach of pellet formation of a filamentous fungus -Rhizopus oryzae.”,  Bioresource Technology 98, 3415-3423, 2007

29.Liao, W.; Liu, Y.; Frear, C.; Chen, S.;  “Co-production of fumaric acid and chitin from a nitrogen-rich lignocellulosic material – dairy manure – using a pelletized filamentous fungus Rhizopus oryzae ATCC 20344”,  Bioresource Technology 99, 5859-5866, 2008

30.Atkinson, B.; Black, G.M.; Lewis, P. J. S.; “Biological Particles of Given Size, Shape, and Density for Use in Biological Reactors", Biotechnology and Bioengineering XXI,  193-200, 1979

31.Hashemizadeh, S.N.; Tavakoli, O.; Tabandeh, F.; Karkhane,  A.; Forghanipour,  Z.; “A Comparative Study of Immobilized-Whole Cell and Commercial Lipase as a Biocatalyst for Biodiesel Production from Soybean Oil”, World Renewable Energy Congress 2011 Sweden , 311-318

32.Saxena, R. K.; Sheoran, A.; Giri, B.; Davidson, W. S.; Purification strategies for microbial lipases, Journal of microbiological methods 52, 1-18,2003

33.Gliseida, B.; Melgar, Z.; Vanessa, F.; Assis, S. D.; Coutinho, L.; Fanti, S. C.; Sette, L.; Growth Curves of Filamentous Fungi for Utilization inBiocatalytic Reduction of Cyclohexanones, Global Journal of Science Frontier Research Chemistry 13, 2013

34.Musani, R.; Basri, M.; Ampon, K.; Yunus, W. M. Z.; Razak, C. N. A.; Extra- and intra-cellular lipases from a thermophilic Rhizopus oryzae and factors affecting their production, Can. J. Microbiol  39, 1991-1994, 1993

35.Dumitriu, S.; Chornet, E.; 2 Processes with immobilized enzymes and cells, Bioconversion of Waste Materials to Industrial Products, 1998

36. Kourkoutas, Y.; Bekatorou, A.; Banat, I.M. M.; Marchant, R.; Koutinas, A. A.; Immobilization technologies and support materials suitable in alcohol beverages production: a review, Food Microbiology 21, 377-397, 2004

37. Bikerstaff,G.F. ;”  Immobilization of enzyme and cell” Totawa, New Jersi Hummana Press,1997

38.Karel S.F.;”The Immobilization of whole cells engineering principles”, Chemical engineering science vol 40 No.8; 1321-1354,1984

39.Ogbonna, J.C.;   Liu, Ying-Chun; Liu, Yu-Kuo; Tanaka, H.; “Loofa ( Luffa cylindrica ) Sponge as a Carrier for Microbial”, Journal of fermentation and bioengineering ,78, 437-442. 1994

40.Paglicawan, M. A.; Cabillon, M. S.; Cerbito, R. P;. Santos, E. O.; Loofah Fiber as Reinforcement Material for Composite, Philippine Journal of Science 134 (2), 113-120, Dec 2005

41.Saeed A. ;Muhammad Iqbal;”Loofa (Luffa cylindrica) Sponge: Review of Development of the Biomatrix Tool for Biotechnological Application” Biotechnol. Prog., Vol. 29, No. 3, 2013

42. Shen, J.; Min Xie, Y.; Huang, X.; Zhou, S.; Ruan, D.; “Mechanical properties of luffa sponge, Journal of the mechanical behavior of biomedical materials” 15,141-152, 2012

43.Cyiindricu, L.; “Characteristics of Loofa (Luffa cylindrica) Sponge as a Carrier for Plant Cell Immobilization, JOURNAL OF FERMENTATION AND BIOENGINEERING 85”, 416-421, 1998

44.Wang, D.; Xu, Y.; Shan, T.; Effects of oils and oil-related substrates on the synthetic activity of membrane-bound lipase from Rhizopus chinensis and optimization of the lipase fermentation media, Biochemical Engineering Journal 41, 30-37, 2008

45.Nakashima, T.; Kyotani, S.; Izumoto, E.; Fukuda, H.; “Cell aggregation as a trigger for enhancement of intracellular lipase production by a Rhizopus species”, Journal of Fermentation and Bioengineering 70, 85-89, 1990

46.Beisson, F.; Rivière, C.; “Methods for lipase detection and assay “: a critical, Eur. J. Lipid Sci. Technol, 2000

47.Gupta, R.; Rathi, P.; Gupta, N.; Bradoo, S.; “Lipase assays for conventional and molecular screening: an overview”, Biotechnol. Appl. Biochem. 37, 63–71, 2003

48.Kiran, K. R.; Krishna, S. H.; Babu, C. V. S.; Karanth, N. G.; Divakar, S.; “An esterification method for determination of lipase activity”, Biotechnology Letters 22, 1511–1514, 2000

49.Duncombe, W. G.; “The colorimetric micro-determination of long-chain fatty acids”, The Biochemical journal 88, 7-10 1963

50.Wu, Xiao Yan; Jeiskeliiinen, S.; Linko, Yu-yen; “An investigation of crude lipases for hydrolysis , esterification , and transesterification”, Enzyme and Microbial Technology 19, 226-231, 1996

51.Abdul Rahman, M. B.; Chaibakhsh, N.; Basri, M.; Salleh, A.; Abdul Rahman, R. N. Z. R.; “Application of artificial neural network for yield prediction of lipase-catalyzed synthesis of dioctyl adipate”, Applied biochemistry and biotechnology 158, 722-735, 2009

52.Kwon, D. Y.; Rhee, J. S.; “A Simple and Rapid Colorimetric Method for Determination of Free Fatty Acids for Lipase Assay”, JAOCS 63, 89-92, 1986

53. Romdhane, I. B.; Romdhane, Z. B.; Gargouri, A.; Belghith, H.; “Esterification activity and stability of Talaromyces thermophilus lipase immobilized onto chitosan”, Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic 68, 230-239,2011

54. Hasan, F.; Shah, A. A.; Javed, S.; Hameed, A.; “Enzymes used in detergents: Lipases”, African Journal of Biotechnology 9, 4836 -4844, Aug 2010

55.Gandhi, N.; “Applications of lipase”, Journal of the American Oil Chemists' Society 1997, 621-634, 1997

56.Hasan, F.; Shah, A. A.; Hameed, A.; “Industrial applications of microbial lipases”, Enzyme and Microbial Technology 39, 235-251, 2006

57. Jaeger, Karl. E.; Reetz, M. T.; “Microbial lipases form versatile tools for biotechnology”, Trends in biotechnology 16, 396-403, 1998

58.Orrego, C. E.; Valencia, J. S.; Zapata, C.;” Candida rugosa Lipase Supported on High Crystallinity Chitosan as Biocatalyst for the Synthesis of 1-Butyl Oleate”, Catalysis Letters 34, 312-322, 2009

59. Long, K.; Ghazali, H.; Ariff, A.; Bucke, C.; “Acidolysis of several vegetable oils by mycelium-bound lipase of Aspergillus flavus”, Journal of the American Oil Chemists' Society 74, 1121-1128, 1997

60.Blain, J.; A.; Patterson, J. D. E.; Shaw, C. E. L.; Cmi, P.; Cmi, R.; “THE NATURE OF MYCELIAL LIPOLYTIC ENZYMES IN FILAMENTOUS FUNGI”, FEMS Microbiology Letters 3, 85-87, 1978

61.Legier, V.;  Comeau L. C.; Applied Microbiology Biotechnology Continuous synthesis of esters by cell-bound fungal lipases in an organic solvent, Appl Microbiol Biotechnol  37 : 732-736, 1992

62.Xu, Y.; Wang, D.; Mu, X. Q.; Zhao, G. A.; Zhang, K. C.; “Biosynthesis of ethyl esters of short-chain fatty acids using whole-cell lipase from Rhizopus chinesis CCTCC M201021 in non-aqueous phase”, Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic 18, 29-37, 2002

63. Salah, R. B.; Ghamghui, H.; Miled, N.; Mejdoub, H.; Gargouri, Y.; Ben Salah, R.; “Production of Butyl Acetate Ester by Lipase from Novel Strain of Rhizopus oryzae”, Journal of bioscience and bioengineering 103, 368-372, 2007

64. Yu, Y.; Wu, D.; Liu, C.; Zhao, Z.; Yang, Y.; Li, Q.; Findrik, Z.; “Pervaporation-aided enzymatic esterifications in non-conventional media”, Process Biochem,2012

65.Romero, C. M.; Pera, L. M.; Loto, F.; Vallejos, C.; Castro, G.; Baigori, M. D.; “Purification of an organic solvent-tolerant lipase from Aspergillus niger MYA 135 and its application in ester synthesis”, Biocatalysis and Agricultural Biotechnology 1, 25-31,2012

66.Kobayashi, T.; “Lipase-catalyzed syntheses of sugar esters in non-aqueous media”, Biotechnology letters 33, 1911-1919, 2011

67.Zaks, A.; Klibanov, A. M.; “Enzyme-catalyzed processes in organic solvents”, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 82, 3192-3196, 1985

68. Ghamgui, H.; , Maha Karra-Chaˆ A.; Gargouri, Y.; “1-Butyl oleate synthesis by immobilized lipase from Rhizopus oryzae: a comparative study between n-hexane and solvent-free system”, Enzyme and Microbial Technology 35, 355-363, 2004

69.Wang, S.; Zhang, W.; Li, Z.; Ren, Z.; Liu, H.; “ Lipase immobilized on the hydrophobic polytetrafluoroethene membrane with nonwoven fabric and its application in intensifying synthesis of butyl oleate”, Applied biochemistry and biotechnology 162, 2015-2026, 2010

70.Habulin, M.; Knez, Z.; “Enzymatic synthesis of n-butyl oleate in a hollow fiber membrane reactor”, Journal of Membrane Science 61, 315-324, 1991

71.Kharrat, N.; Ali, Y.; Marzouk, S.; Gargouri, Y.; Karra-Châabouni, M.;” Immobilization of Rhizopus oryzae lipase on silica aerogels by adsorption: Comparison with the free enzyme”, Process Biochemistry 46, 1083-1089, 2011

72.Kraai, G.N.; Winkelman, J.G.M.; de Vries, J.G; Heeres, H.J.; “Kinetic studies on the Rhizomucor miehei lipase catalyzed esterification reaction of oleic acid with 1-butanol in a biphasic system”, Biochemical Engineering Journal 41, 87-94, 2008

73.Knothe, G.;” Dependence of biodiesel fuel properties on the structure of fatty acid alkyl esters”, Fuel Processing Technology 86, 1059-1070, 2005

74.Ribeiro, M.; Pinto, A. C.; Quintella, C. M.; Rocha, G. O.; Teixeira, L. S. G.; Guarieiro, L. N.; Rangel, C.; Veloso, C. C.; Rezende, M. J. C.; Serpa, R.; Oliveira, A. M. D.; Torres, E. A.; Andrade, J. B. D.; “The Role of Additives for Diesel and Diesel Blended ( Ethanol or Biodiesel ) Fuels” : A Review Nu, Energy & Fuels 21, 2433-2445, 2007

75. Chang, S. W.; Shaw, J. F.; “Biocatalysis for the production of carbohydrate esters”, New biotechnology 26, 109-116, 2009

76.Okullo, A.; Temu, A. K.; Ogwok, P.; Ntalikwa, J. W.; “Physico-Chemical Properties of Biodiesel from Jatropha and Castor Oils”, Internatinal Journal of renewable energy research, 2012

77.Linko, Y.; La, M.; “Biodegradable products by lipase biocatalysis”, Journal of Biotechnology 66, 41–50, 1998

78.O’Rourke .S “High Performance Ester Plasticizers” The HallStar Company,technical publication, 2001

79.Michael andirene Ash       “Handbook of Green Chemicals Second Edition Handbook of Green Chemicals Second Edition” Compiled by Synapce Information resource INC,2004

80.http://www.mycobank.org/

81.Dahot, M .; Khan, M. Y.; Xu, J. H.; Rafiq, M.; “Usage of suger cane bagass as an energy source for the production of lipase byAspergillus Fumigatus”., Pak. J. Bot. 45, 279-284, 2013

82.Jones, C. L.; Lonergan, G. T.; Mainwaring, D. E.; “The use of image analysis for spore count of white –root”, Biotechnology Technique 6,417-422, 1992

83.Pinsirodom,P.; Kirk L. Parkin;” Current Protocols in Food Analytical Chemistry Unit c3.1 Lipase Assays” John Wiley & Sons, Inc. Published Online: 2001

84. Oliveira A. C. D.; Watanabea F. M.F.;Vargas J.V. C.; Rodrigues M. L. F., Marianoa A.B.;” Production of methyl oleate with a lipase from an endophytic yeast isolated from castor leaves” Biocatalysis and Agricultural Biotechnology 1295–300 ,2012

85. Lowry, R. R.; Tinsley, I. J.; “Rapid colorimetric determination of free fatty acids”, Journal of the American Oil Chemists' Society 53, 470-472, 1976

86.Shuler M.L.; Kargi F.;”Bioprocess engineering basic concepts 2nd edition” Pentic Hall of India ,2002

87.Doran P.;” Bioprocess engineering principles”Academic Press ,1995

88. Krishna, S. H.; Divakar, S.; Prapulla, S. G.; Karanth, N. G.; Hari Krishna, S.; "Enzymatic synthesis of isoamyl acetate using immobilized lipase from Rhizomucor miehei", Journal of biotechnology 87, 193-201, 2001

89. Foresti, M.L.; Pedernera, M.; Bucalá, V.; Ferreira, M.L.; "Multiple effects of water on solvent-free enzymatic esterifications", Enzyme and Microbial Technology 41, 62-70, 2007

90.Duan, Y.; Du, Z.; Yao, Y.; Li, R.; Wu, D.; Effect of molecular sieves on lipase-catalyzed esterification of rutin with stearic acid, Journal of agricultural and food chemistry 54, 6219-6225, 2006

91.Elibol, M.; Lipase production by immobilised Rhizopus arrhizus, Process Biochemistry 36, 219–223, 2000

92.  Bell G. ;Blain J.A.;Patterson J.E.D;”Ester and glysrides synthesis by Rhizopus Arhinius Mycelia”FEMS microbial letters 3,223-2