فهرست:
فصل اول: مقدمه و مروری بر منابع
1-مقدمه............................................................................................................................... 2
1-1- مقدمهای بر مرکبات………………………………………………………………………2
1-2- تاریخچه‌ی کشت درختان مرکبات در ایران و جهان…………………………………………4
1-3- سطح زیر کشت، میزان تولید و عملکرد درختان مرکبات در ایران و جهان…………………….4
1-4- اهمیت و انواع بیماریهای مرکبات………………………………………………………...6
1-4-1- تاریخچه و اهمیت بیماری شانکر مرکبات……………………………………………….7
1-4-2- عامل بیماری…………………………………………………………………………10
1-4-3- علایم و چرخه‌ی بیماری……………………………………………………………...13
1-4-4- ابزارهای ایجاد بیماری تحت اختیار باکتری……………………………………………..14
1-4-5- جذب، اتصال و ورود باکتری به گیاه…………………………………………………...14
1-4-6- سیستم‌های ترشحی باکتری……………………………………………………………15
1-4-7- سیستم ترشحی نوع III (TTSS)………………………………………………………16
1-4-8- ژن‌های hrp و نقش دوگانه‌ی آنها………………………………………………….......17
1-4-9- هارپین‌ها و نقش آنها در القای پاسخ ………………………………………………HR20
1-5- بهره‌گیری از مهندسی ژنتیک در مقاومت به بیماری‌ها………………………………………21
فصل دوم: مواد و روشها
2- محل انجام پژوهش...........................................................................................................25 25
2-1- مواد شیمیایی، آنزیمها و کیتها………………………………………………………….25
2-2- سویههای باکتری………………………………………………………………………..25
2-3- پلاسمیدهای مورد استفاده……………………………………………………………….26
2-4- محیط کشت باکتری‌ها……………………………………………………………….......26
2-5- آنتیبیوتیکها…………………………………………………………………………...27
2-6- طراحی آغازگر………………………………………………………………………….27
2-7- شناسایی و جداسازی باکتری Xcc.................................................................................................29
2-8- خالص سازی DNA ژنومی باکتری Xcc سویهی ………………………..NIGEB.088(A*)31
2-9- تعیین کمیت و کیفیت DNA استخراج شده……………………………………………….31
2-10- واکنش زنجیرهای پلیمراز با آنزیمهایTaq و Pfu دی.ان.آ پلیمراز جهت جداسازی ژن‌های هدف........................................................................................................................................................31
2-11- الکتروفورز محصولات واکنش زنجیرهای پلیمراز…………………………………............33
2-12- خالصسازی محصول واکنش زنجیرهای پلیمراز………………………………………….33
2-13- جداسازی محصول PCR و یا محصول حاصل از هضم آنزیمی از روی ژل آگارز…………...34
2-14- هضم آنزیمی با آنزیمهای محدود کننده تیپ …………………………………………..II35
2-15- الکتروفورز محصولات واکنشهای هضم آنزیمی…………………………………………39
2-16- واکنش اتصال………………………………………………………………………….39
2-17- تکثیر پلاسمید………………………………………………………………………....42
2-18- اندازهگیری دانسیته نوری(OD) باکتری…………………………………………………..42
2-19- تکنیک Colony-PCR: غربالگری کلونیهای نوترکیب……………………………………42
2-20- استخراج پلاسمید در مقیاس کم ……………………………………(Mini-Preparation)43
2-21- توالییابی……………………………………………………………………………...43
2-22- انتقال پلاسمیدهای نوترکیب pBI-hrpW و pBI-hrpG به سویههای آگروباکتریوم تومفاسینس با استفاده از روش ذوب و انجماد………………………………………………………………...43
فصل سوم: نتیجهگیری و بحث
3- شناسایی باکتری Xcc (A*)......................................................................................................................................47
3-1- شناسایی به کمک تست بیماریزایی بر روی گیاه میزبان C.auratifolia.......................................47
3-2- شناسایی به کمک آغازگرهای اختصاصیMS+/MS- و Xac01 / Xac02.....................................48
3-3- استخراج DNA ژنومی از باکتری XCC.......................................................................................49
3-4- تعیین کیفیت و کمیت DNA استخراج شده………………………………………………50
3-5- تکثیر ژن‌هایhrpW و hrpG با واکنش زنجیرهای پلیمراز………………………………….51
3-5-1- طراحی آغازگرهای مناسب…………………………………………………………...51
3-5-2- بهینهسازی شرایط واکنش زنجیرهای پلیمراز……………………………………………51
3-5-3- الکتروفورز محصول واکنش زنجیرهای پلیمراز………………………………………….53
3-6- تایید ناقلهای کلونینگ و بیانی از طریق الگوهای برشی حاصل از هضم توسط آنزیمهای برشی نوع II.......................................................................................................................................................54
3-7- همسانهسازی ژن‌هایhrpG و hrpW در ناقلهای کلونینگ (PGEM7zf(-) , pUC19).............55
3-8- تایید همسانهسازی ژن‌های هدف در ناقلهای کلونینگ (pGEM7zf(-))،( pUC19)..................57
3-8-1- واکنش کلونی PCR کلونهای گزینش شده……………………………………………57
3-8-2- تایید همسانهسازی ژن‌هایhrpW/G در ناقلهای کلونینگ با روش هضم آنزیمی………...58
3-8-3- تایید همسانهسازی ژن‌های hrpW/G در ناقلهای کلونینگ با روش واکنش زنجیرهای پلیمراز......................................................................................................................................................59
3-9- همسانه سازی ژن‌های hrpG/W در ناقل بیانی pBI121...............................................................59
3-10- تایید همسانه سازی ژن‌های hrpG/W در ناقل بیانی pBI121....................................................62
3-10-1- واکنش کلونی PCR کلونهای تشکیل شده…………………………………………...62
3-10-2- تایید همسانهسازی ژن‌های hrpG/W در ناقل بیانی pBI121 با روش واکنش هضم آنزیمی.63
3-10-3- تایید همسانهسازی ژن‌های hrpW/G در ناقل بیانی pBI121 با روش واکنش زنجیرهای پلیمراز……………………………………………………………………………………….64
3-11- توالییابی……………………………………………………………………………..65
3-11-1- نتایج توالییابی……………………………………………………………………..66
3-12- انتقال پلاسمیدهای نوترکیب pBI.hrpG و pBI.hrpW به سویههای آگروباکتریوم تومفاسینس.67
3-13- تایید انتقال پلاسمیدهای نوترکیب pBI.hrpW/G به سویههای آگروباکتریوم تومفاسینس……..67
3-13-1- تایید انتقال پلاسمیدهای نوترکیب pBI.hrpW/G با روش کلونی PCR................................67
فصل چهارم: جمعبندی کلی و پیشنهادها
4- جمعبندی کلی نتایج……………………………………………………………………….70
4-1- پیشنهادها………………………………………………………………………………71
پیوست
5- دستورالعمل استخراج و خالصسازی DNA ژنومی باکتری xanthomonas citri pv. citri سویه 088(A*) NIGEB-......................................................................................................................................................84
5-1- محلولهای لازم جهت استخراج DNA ژنومی……………………………………………84
5-1-1- مراحل استخراج DNA ژنومی………………………………………………………...85
5-1-2- روش اسپکتروفوتومتری………………………………………………………………86
5-1-3- الکتروفورز بر روی ژل آگارز………………………………………………………….87
6- الکتروفورز با ژل آگارز................................................................................................. 88
6-1- نمای ساده از دستگاه الکتروفورز…………………………………………………………88
6-2- ژل آگارز……………………………………………………………………………….89
6-3- اتیدیوم بروماید………………………………………………………………………....89
6-4- بافر بارگزاری ژل آگارز………………………………………………………………….90
6-5- طرز تهیه محلول …………………………………………………………….TBE 0.5X91
6-6- طرز تهیه آگارز 1%...........................................................................................................91
7- دستورالعمل خالصسازی فرآورده‌های تکثیر شده و قطعات DNA از روی ژل آگارز.....................92
7-1- خالصسازی فرآورده‌های تکثیر شده با کیت ……………………………………..Bioneer92
7-2- خالصسازی قطعات DNA از ژل آگارز.......................................................................................93
8- دستورالعمل تهیه باکتری‌های مستعد برای پذیرش DNA خارجی...........................................95
8-1- تهیه سلولهای مستعد E.coli.......................................................................................95
8-2- دستورالعمل تراریزش باکتری مستعد به روش شوک حرارتی......................................................96
8-3- تهیهی سلولهای مستعد و انتقال پلاسمیدهای نوترکیب pBI-hrpW و pBI-hrpG به سویههای آگروباکتریوم تومفاسینس با استفاده از روش ذوب و انجماد................................................................97
9- استخراج پلاسمید در مقیاس کم از باکتری E.coli سویه DH5α.....................................................99
9-1- استخراج پلاسمید به روش دستی………………………………………………………...99
9-2- استخراج پلاسمید با استفاده از کیت MBST (دکتر شایان)………………………................101
9-3- روش تهیه محلول های IPTG و ………………………………………………...X-Gal103
9-3-1- تهیه محلول ایزوپروپیل D-B تیوگالاکتوپیرانوزید (IPTG)....................................................103
9-3-2- تهیه 5 برمو-3 کلرو- اتیدولیل D-B گالاکتوزید (X-Gal)……………………………...103
10- تهیه مایه تلقیح و بهینهسازی شرایط مایهزنی گیاه میزبان..............................................................103
منبع:
ندارد.